style="width:2.73335in;height:0.6534in" /> …………………… (1) 本文是学习GB-T 34794-2017 琼脂糖凝胶回收试剂盒测定通则. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了柱式琼脂糖凝胶回收试剂盒的DNA 回收产物评估指标及测试方法。
本标准适用于柱式琼脂糖凝胶回收试剂盒的测定。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 11165 实验室 pH 计
GB/T 26813 双光束紫外可见分光光度计
JJG 646 移液器检定规程
YY/T 0087 电泳装置
YY/T 0657 医用离心机
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
DNA 纯化 DNA purification
采用适当方法降低可以观察到的或可测量到的连接、酶切、标记、扩增等抑制物的过程，为获得更高
纯度 DNA。
3.2
DNA 回收率 DNA recovery rate
即 DNA 回收得率， DNA 目的片段回收后与回收前的产量百分比。
3.3
最大上样量 column reservoir capacity
单个吸附柱的单次最大上样体积。
3.4
吸附柱的承载量 binding capacity
单个吸附柱每次最多可吸附 DNA 的量。其决定了单次回收的DNA 最大量。
介质吸附法是一种常用的纯化核酸的方法。柱式回收试剂盒是将硅胶膜或其他吸附介质固定在离
心柱上作为吸附剂，在高盐(如3.0 mol/L～5.0 mol/L盐酸胍)低 pH(5.0
mol/L～6.5 mol/L)状态下，
GB/T 34794—2017
吸附柱专一性地吸附 DNA; 而在低盐(TE 或者2.5 mmol/L
Tris-HCl)或水溶液状态下，DNA 被洗脱
下来。
5.1 离心机：转速10000 r/min 以上，应符合YY/T 0657 的要求。
5.2 水浴锅或金属浴：温度范围60℃~70℃。
5.3 电泳系统，应符合YY/T 0087 的要求。
5.5 可调移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL、0.5 mL～5
mL,应符合JJG 646 的要求。
5.6 紫外分光光度计，应符合 GB/T 26813 的要求。
5.7 pH 计，应符合GB/T 11165 的要求。
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水为GB/T
6682规定的一级水。所有试剂溶液(含水
溶液)宜大体积配制、小体积分装经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22
μm 膜过滤除菌；酶
溶液应避免反复冻融。
6.1 三羟甲基氨基甲烷 (Tris)。
6.2 盐酸 (Hydrochloric acid,HCl)。
6.3 氢氧化钠(Sodium hydroxide,NaOH)。
6.4 乙酸钠(sodium acetate,NaAc)溶液：3 mol/L,用乙酸调 pH 至5.2,0.22 μm
膜过滤。
6.5 乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium
salt,Na₂EDTA,Ci₀H₁₄N₂O₈Na₂)。
6.6 无水乙醇(alcohol,C₂H₃OH),4℃ 保存及使用。
6.7 琼脂糖(Agarose,AG)。
6.8 核酸染剂(如 Gold View 等染料)。
6.9 上样缓冲液(Loading buffer)。
6.10 DNA 标准品(Hind Ⅲ 酶切的λDNA 产物)。
6.11 100倍电泳缓冲液溶液(TAE):4 mol/L Tris-HCl(pH8.0),2 mol/L
醋酸钠，200 mmol/L EDTA。 使用时稀释100倍。
6.12 TE 缓冲液(pH 8.0):10 mmol/L Tris-Cl,1 mmol/L EDTA,使用HCl 或 NaOH
调节 pH,4℃
保存备用。
将不同的 DNA Fragment(10 bp～ 20000 bp)用 TE 缓冲液分别配制成1μg/μL 的
DNA 标准溶
液备用。
GB/T 34794—2017
7.1.1 DNA Fragment 1(片段范围为10 bp～100 bp,不含100 bp):20 bp(记为 DNA
1)、50 bp(记为 DNA 2)、80 bp(记为 DNA
3)或取均匀分布在范围内的任意其他3个不同大小的DNA 片段。
7.1.2 DNA Fragment 2(片段范围为100 bp～1000 bp,不含1000 bp):100
bp(记为 DNA 4) 、500 bp
(记为 DNA 5)、800 bp(记为 DNA
6)或取均匀分布在范围内的任意其他3个不同大小的DNA 片段。
7.1.3 DNA Fragment 3(长度范围为1000 bp～10000 bp,不含10000 bp):1000
bp(记为 DNA 7)、 2000 bp(记为DNA 8)、5000 bp(记为DNA 9)、8000 bp(记为
DNA 10)或取均匀分布在范围内的任
意其他4个不同大小的 DNA 片段。
7.1.4 DNA Fragment 4(长度范围为10000 bp～20000 bp,不含20000
bp):10000 bp(记为 DNA 11)、15000 bp(记为 DNA 12)、20000 bp(记为 DNA
13)或取均匀分布在范围内的任意其他3个不同 大小的 DNA 片段。
用移液枪向吸附柱中加入蒸馏水至刻度，记录加入的蒸馏水体积即为吸附柱的最大上样量。
将800 bp (或按照待测试剂盒说明中可回收片段的任意片段)DNA Fragment
溶液按照表1体系
混合 DNA 溶液与胶回收试剂盒的溶胶液后加入吸附柱。
表 1 吸附柱的承载量
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按照待检测的试剂说明书进行后续清洗、洗脱步骤，收集回收液，采用紫外分光光度计法，测定回
收的DNA 溶液在260nm 处的吸收值，利用A26=1 相当于50 μg/mL 的 DNA
来计算回收DNA 的浓 度，乘以回收液体积可得回收的DNA 总量，以DNA
上样量为横坐标绘制回收量曲线图，曲线上限即为
吸附柱的承载量。
纯度按照以下步骤进行测定：
a)
根据试剂盒说明书，选取待测试剂盒可回收片段范围内的任意3个不同大小的
DNA 标准溶
液进行琼脂糖凝胶电泳(上样时确保避免损坏凝胶和样品无溢出)。电泳完成后在紫外凝胶成
像仪上观察DNA
条带的位置，分别用刀片切下各目的条带用于胶回收。回收步骤、操作流程
和试剂用量按照待测的胶回收试剂盒说明书进行。
b) 采用紫外分光光度计法，将试剂盒回收得到的DNA
溶液进行适当稀释，使样品溶液在260 nm
处的吸收值在0.1～0.5之间，以稀释液做参比，测定样品溶液在260 nm、280
nm、230 nm 处
GB/T 34794—2017
的吸收值，计算A/A₂,A/A₂3
的比值。
c) 重复测定3次，求得各平均比值。根据经验公式：A/A
可认为回收的 DNA 纯度合格。
在1.8±0. 1范围，A26/A23>1.7,
7.4.2 相对分子质量大小及完整性测定
在7.4.1 a) 电泳结束后，在凝胶成像系统上观察 DNA
条带相对分子质量大小及降解程度。
符合纯度要求后，利用A26=1 相当于50μg/mL 的双链 DNA 来计算 DNA 的浓度。
回收率按照以下步骤进行测定：
a) 按照7. 1配制 DNA Fragment 1,DNA Fragment 2,DNA Fragment 3,DNA
Fragment 4 标准 溶液，分别记为 DNA 1 、DNA 2 、DNA 3 、DNA 4 、DNA 5
、DNA 6 、DNA 7 、DNA 8 、DNA 9、 DNA 10 、DNA11 、DNA12
、DNA13。进行琼脂糖凝胶电泳(上样时确保避免损坏凝胶和样品
无溢出),同时用双蒸水进行空白对照记为 DNA0 。
电泳完成后在紫外凝胶成像仪上观察 DNA
条带的位置，分别用刀片切下各目的条带用于胶回收。回收步骤、操作流程和试剂用量
按照待测的胶回收试剂盒说明书进行。
b) 采用紫外分光光度法，测定 DNA0～ DNA13溶液及凝胶回收后的 DNAr0～
DNAr 13 在 260nm 处的吸收值，分别记为 A 。～A3 和 A～A 。
扣除吸光度空白后，用回收率公式计算 得出回收率 pi～Pi₃。
c) 重 复a)～b), 分别求得 b) 和 c) 中各片段的平均回收率D₁ ~D13。
d) 求回收率平均值p 作为该DNA Fragment 标准溶液的回收率。
e) 回收率p 计算见式(1):
style="width:2.73335in;height:0.6534in" /> …………………… (1)
式中：
Ax— 测得的回收的 DNA 溶液的吸光度；
Vx—— 切胶回收体积；
A 、——测得的 DNA 标准溶液吸光度；
V 、——电泳上样体积。
f) 以回收率p 。为纵坐标(%),DNA Fragment 为横坐标(单位 bp)
作图，得出不同大小DNA 片 段的回收率图。
7.5.2 不同 DNA 起始量的回收率测定
取800 bp (或100 bp～10000 bp 中典型片段的任意片段)DNA Fragment
溶液标准溶液0.5 μL 、 1μL 、2μL 、3μL 、5μL 、8μL
进行琼脂糖凝胶电泳(上样时确保避免损坏凝胶和样品无溢出)。电泳完
成后在紫外凝胶成像仪上观察DNA
条带的位置，分别用刀片切下各目的条带用于胶回收。回收步骤、
操作流程和试剂用量参照待测的胶回收试剂盒说明书进行。
测定和计算方法同7.5.1。以回收率为纵坐标(%),加样量为横坐标(单位μg)
作图，得出不同起始
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量 DNA 的回收率图。
从7.5所得的不同大小DNA
片段的回收率图上，查出回收率大于或等于60%的最小片段与最大
片段即为可回收片段范围。
相关DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒技术指标要求建议，可参见附录 A。
GB/T 34794—2017
(资料性附录)
DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒技术指标要求
相 关 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒技术指标要求见表 A.1。
表 A.1 DNA 回收试剂盒技术指标要求建议表
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10 μg | 10 μg | 10 μg |
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400 mg | ||
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30 μL |
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800 μL |
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